Ganoderma lucidum polysaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immuno-stimulatory function

Ganoderma lucidum polysaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immuno-stimulatory function

Previous studies demonstrated Ganoderma lucidum polysaccharides (GL-PS), a form of bioactive β-glucan can stimulate the maturation of monocyte-derived dendritic cells (DC). The question of how leukemic cells especially in monocytic lineage respond to GL-PS stimuli remains unclear.

Results
In this study, we used in vitro culture model with leukemic monocytic cell-lines THP-1 and U937 as monocytic effectors cells for proliferation responses and DCs induction. We treated the THP-1 and U937 cells with purified GL-PS (100 μg/mL) or GL-PS with GM-CSF/IL-4. GL-PS alone induced proliferative response on both THP-1 and U937 cells but only THP-1 transformed into typical DC morphology when stimulated with GL-PS plus GM-CSF/IL-4. The transformed THP-1 DCs had significant increase expression of HLA-DR, CD40, CD80 and CD86 though not as high as the extent of normal monocyte-derived DCs. They had similar antigen-uptake ability as the normal monocyte-derived DCs positive control. However, their potency in inducing allogeneic T cell proliferation was also less than that of normal monocyte-derived DCs.

Conclusion
Our findings suggested that GL-PS could induce selected monocytic leukemic cell differentiation into DCs with immuno-stimulatory function. The possible clinical impact of using this commonly used medicinal mushroom in patients with monocytic leukemia (AML-M4 and M5) deserved further investigation.

Background
In both Western and Oriental societies, cancer patients commonly take complementary and alternative medicine while they underwent conventional anti-cancer therapy [1-3]. Among different kinds of alternative medicine, herbal medicine is the most popular form taken by patients in United Kingdom [4]. In our community, more than 42% of our pediatric cancer patients took herbal medicine when they received conventional chemotherapy [5]. Among them, the commonest herb being used is the extracts derived from Ganoderma lucidum.

Ganoderma lucidum (GL) is a traditional Chinese medicine known by the layman as the "herb of immortality". It was used as a health tonic to promote longevity for more than two thousands years. It has two major groups of bioactive components: polysaccharides and triterpenes. In recent decade, they have been extensively studied because of its potential immunomodulating and anti-tumor effects as demonstrated in both in vitro and in vivo models [6]. So far, currently available data suggested that GL polysaccharides exert anti-cancer functions indirectly by activation of host's immune responses whereas GL triterpenes can kill cancer cells directly via its direct cytotoxic effect [7]. GL polysaccharides are purified from the mushroom mycelium and they contain branched β-glucan.

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells and have unique ability in linking innate and adaptive immunity. Due to the scarcity of circulating DCs, the current protocol to study DCs biology and differentiation is mainly through differentiation of monocytes to DCs with the cytokines GM-CSF and IL-4. Recently, DCs can be induced from acute myeloid leukemic cells (AML) and this raised the possibility of using DCs derived from autologous leukemic cells for therapeutic uses [8]. Several AML cell-lines including monocytic THP-1, KG-1 and CD34+ MUTZ3 cell-lines have been used as cellular models to study the differentiation of leukemic cells and DCs biology. However, the differentiation protocols differed greatly. For example, mature DCs could only be derived from THP-1 and KG-1 by adding GM-CSF and IL-4 together with ionomycin and TNF-α [8]. Interestingly, all study agreed that there is impaired response of leukemic DC to LPS directed DCs maturation [9]. This suggested that these leukemic DCs are somehow defective in response to maturation stimuli.

We and other groups demonstrated GL mycelium polysaccharides have the ability to stimulate the maturation of human DCs [10-12]. While most reports advocating the immunomodulating role of GL on normal monocytic cells, our data provided a novel observation that GL polysaccharides may also enhance monocytic leukemic cells proliferation and induce dendritic cells differentiation from monocytic leukemic blasts. The awareness of such phenomenon may help us to design specific treatment approach for monocytic leukemia.

Results
Cell proliferation response of THP-1 after GL polysaccharides stimulation
To relay the GL-PS has effect on leukemic cells, we evaluated the effect of GL polysaccharides (GL-PS) on the acute myeloid leukemia (AML) cell-lines THP-1 and U937 by cell proliferation assay. GL-PS alone at the dose of 100 μg/mL could stimulate the growth of both THP-1 and U937 cells. The average increases after the three-day exposure in THP-1 and U937 cells were 1.53-fold and 1.16-fold higher than the untreated control, respectively (Fig. 1A). Vincristine, a chemotherapeutic drug, was used as control to show the cells were responding. The cell cycle analysis with PI staining showed that GL-PS did not induce S phase arrest during the three-day treatments (Fig. 1B). By checking the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), which is an S-phase marker, both THP-1 and U937 cells showed increases in PCNA expression after GL-PS treatment (Fig. 1C).

thumbnailFigure 1. (A) Leukemic cell proliferation induced by GL polysaccharides. The time-response curves for the effect of GL polysaccharides (GL-PS, -▪-) at 100 μg/mL and vincristine (-▫-) at 0.1 μM on THP-1 (Left panel) and U937 cells (right panel) determined by XTT cell proliferation assay. The results represent the mean ± SD of triplicate cultures of three representative experiments. *p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001 versus negative control (-•-). (B) Cell cycle analysis with PI staining. The THP-1 (left panel) and U937 cells (right panel) were treated with or without 100 μg/mL GL-PS for three days. The cell cycle analysis was then analyzed with PI staining and Cylchred Version 1.0.2 (Cardiff University, Wales, UK). The results shown were from one representative experiment of three independent experiments performed. (C) PCNA expression of GL-PS treated THP-1 (upper panel) and U937 cells (lower panel) in three-day incubation. The results shown were from one representative experiment of three independent experiments performed.
Induction of DCs-like morphology and phenotype in GL-PS treated THP-1 cells
Under GL-PS treatment (100 μg/mL was used in all experiments onwards), we observed DC-like morphology in THP-1 cell culture. Since reports suggest that THP-1 can be induced into DC by a combination of cytokines [8,13], we hypothesized that GL-PS might also induce or enhance the differentiation of THP-1 cells into THP-1 DCs. We cultured these cells in the presence of GM-CSF/IL-4 with or without GL-PS. We used Mo-DCs as positive control and untreated THP-1 cells as negative control. THP-1 treated with GL-PS plus GM-CSF/IL-4 yielded atypical large adherent and elongated cells with multiple cytoplasmic spikes (white arrow) comparing to the round floating THP-1 cells and typical Mo-DCs with multiple satellite-like cytoplasmic protrusions (Fig. 2A). Under the forward and side scatter analysis of flow cytometry (lower panel), we found that the THP-1 DCs derived with GL-PS (GL-PS THP-1 DCs) had larger size as if the monocytes when differentiated into DCs. For U937 cells, we did not observe similar morphological changes (data not shown).

thumbnailFigure 2. Dendritic cell-like phenotype of THP-1 induced by GL-PS and GM-CSF/IL-4. (A) Microscopic morphology of normal mature monocyte-derived DCs (Mo-mDCs) and THP-1 DCs (upper panel). The round THP-1 cells changed to be adherent flatten cells (white arrows). Under forward scatter and side scatter analysis of flow cytometer (lower panel), the THP-1 DCs increased in size when compared with THP-1 cells alone. (B) Surface expression of antigen presentation and costimulation molecules on immature Mo-DCs (Mo-iDCs), THP-1 cells alone, THP-1 stimulated with GM-CSF/IL-4; GL-PS treated THP-1, THP-1 stimulated with both GL-PS and GM-CSF/IL-4. The expressions of DC maturation markers CD11c, HLA-DR, CD40, CD80 and CD86 on DCs were analyzed by flow cytometer after five-day differentiation. The results shown were from one representative experiment of triplicate independent experiments performed. (C) The average relative expression of the DC maturation markers. The results were presented as mean ± SD of three representative experiments. *p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001 versus that of THP-1 cells.
Phenotypic maturation of THP-1 DCs derived with GL-PS
We then checked the surface expression of antigen presentation molecules and costimulation molecules, which Mo-DCs normally express. In Fig. 2B, we found that the THP-1 expressed relatively low levels of CD11c, HLA-DR, CD40, CD80 and CD86 when compared with normal Mo-DCs. Challenge of THP-1 with GM-CSF/IL-4 and GL-PS demonstrated increase in all markers when it was compared with the untreated THP-1 cells. To check the experimental consistency, we then normalized the fluorescence intensity from four experiments using the CD marker expression in THP-1 cells alone as the 100% (Fig. 2C). GL-PS alone could induce significant increase in CD11c, HLA-DR and CD40 when compared with the negative control THP-1 cells alone. But together with cytokine, the GL-PS THP-1 DCs showed significant increase in all five CD marker expressions, suggesting phenotypic maturity. The GM-CSF/IL-4 alone did not always increase the maturation marker expression in THP-1. To show the specificity of DC differentiation in THP-1 cells, we repeated the experiments on U937 cells. However, there was no significant increase in all DCs maturation markers (data not shown).

Loss of cell proliferation response after added with cytokines
To show the differentiation commitment of the GL-PS treated THP-1 cells in the presence of GM-CSF/IL-4, we added GM-CSF/IL-4 to the THP-1 cells, which had been treated with GL-PS for three days. We monitored the cell growth for two more days (Day 4 and 5) by XTT proliferation assays (Fig. 3A). Adding GM-CSF/IL-4 induced significant increase in proliferation in GL-PS treated THP-1 on Day 4. However, the proliferation became static after Day 5. We confirmed the cell proliferation results with cell counting using trypan blue exclusion assay. As shown in Fig. 3B, we recorded significant increase in cell number when either GM-CSF/IL-4 or GL-PS was added to the THP-1 cells on Day 5. When both GL-PS and GM-CSF/IL-4 were added, the cell number retained similar to the negative untreated THP-1. The decrease was not due to the cell death as indicated by the trypan blue staining (data not shown).

thumbnailFigure 3. Proliferation capacity of THP-1 cells treated with GL-PS after adding GM-CSF/IL-4. (A) Effect of adding GM-CSF/IL-4 to THP-1 after three-day treatment of GL-PS as determined by XTT proliferation assay. The results represented the mean ± SD of three representative experiments. *p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001 versus that without GM-CSF/IL-4 added. (B) Trypan blue exclusion assay. THP-1 cells after adding either GM-CSF/IL-4 or GL-PS were counted. The results represented the mean ± SD of three representative experiments. *p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0.001 versus that of THP-1 cells.
Upregulated endocytotic activity of THP-1 DCs derived with GL-PS
We examined the endocytotic activity of the THP-1 DCs using fluorescent labeled FITC-dextran as antigens and incubated them at 37°C. We used PBS as negative control as well as parallel experiments at 4°C to serve as the background fluorescence. We found that the THP-1, THP-1 DCs with GM-CSF/IL-4 and THP-1 with GL-PS showed similar antigen uptake ability (Fig. 4A). For the GL-PS THP-1 DCs, we unexpectedly found that there was an increase in antigen uptake signals from the FITC-dextran after normalizing with the negative control (Fig. 4B). In order to rule out the possibility of upregulation of mannose receptor, which could account for the uptake of FITC-dextran, we determined the expression level of mannose-receptor and we found no change was observed (data not shown).

thumbnailFigure 4. Endocytosis of FITC-dextran by THP-1 cells and THP-1 DCs. (A) Treated DCs were incubated with FITC-dextran for 1 h at 37°C and then washed for four times. Increase shift in fluorescence intensity (x-axis) was compared with the control, the one without FITC-dextran. The result was from one representative experiment of three independent repeats. (B) The increase in fluorescence intensity was calculated when compared with that of THP-1 cells alone after normalized with the background fluorescence, which was from the parallel experiments performed for all cells at 4°C. The results represented the mean ± SD from three independent experiments. ** p < 0.01 versus that of THP-1 cells.
Low IL-12 and IL-10 production in THP-1 DCs derived with GL-PS
We detected low amount of IL-12 production from THP-1 cells, THP-1 DCs with GM-CSF/IL-4, THP-1 with GL-PS and GL-PS THP-1 DCs (Fig. 5A). Though THP-1 DCs with or without GL-PS had relatively higher IL-12 production, the amount was not significant. In contrast, GL-PS THP-1 DCs showed significant increase in IL-10 production (Fig. 5B).

thumbnailFigure 5. (A) IL-12p70 and (B) IL-10 productions from THP-1 with and without GM-CSF/IL-4 or GL-PS. The culture supernatants were collected and assayed by ELISA in duplicate. The detection ranges for IL-12 and IL-10 were 31.25–2000 pg/mL and 62.5–4000 pg/mL, respectively. The results represented the mean ± SD of four independent experiments for IL-12 and three independent experiments for IL-10. ***p < 0.001 versus that of THP-1 cells.
Decrease in T cell proliferation in allogeneic mixed lymphocyte reaction
We determined the outcome of those THP-1 DCs when they were co-cultured with normal CD3+ T cells, with immature and mature Mo-DCs as positive control. Significant increase in T cell proliferation was induced from immature to mature DCs (Fig. 6A, left). Interestingly, we found that there was a suppression of T cell proliferation in the co-culture of GL-PS THP-1 DCs when compared with other THP-1 cells or THP-1 DCs (Fig. 6A, left). When compared with THP-1 cells alone, the GL-PS THP-1 DCs showed significant decrease in T cell proliferation (Fig. 6A, right). We then examined that the suppression of T cell proliferation was not due to the induction of apoptosis (data not shown). The suppression did not focus on the CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells indicated by no significant change in CD4/CD8+ ratio (Fig. 6B).

thumbnailFigure 6. (A) Allogeneic mixed lymphocyte reaction of normal mature Mo-DCs (-c-); immature Mo-DCs (-r-); THP-1 cells alone (-▲-); THP-1 cells with GL-PS (-○-); THP-1 DCs (-▪-) and GL-PS THP-1 DCs (-●-) with CD3+ T cells in the ratio of 1:10 and 1:100.The optical densities of incorporated BrdU from DC:T co-cultures were normalized with that from T cells alone. The results represented one experimental result of three independent experiments. The results represented the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 versus that of THP-1 cells alone. (B) CD4/CD8 ratio of the co-cultured T cells. The co-cultured T cells so harvested were stained with CD4 and CD8 antibody and analyzed with flow cytometry. The results represented the mean ± SD of two independent experiments. **p < 0.01 versus that of T cells alone.
Discussion
We demonstrated herein that purified immunomodulatory GL polysaccharides, which have been widely used as adjuvant therapy for anti-tumor purposes, could induce both monocytic leukemic cell proliferation and abnormal cellular differentiation in the form of immunoregulatory DCs. Interestingly, such proliferative stimulation was not found in other non-monocytic lymphoid and myeloid leukemic cell lines tested (data not shown), suggesting such effect was lineage specific. We also explored the possibility of using GL-PS to induce DCs from autologous blast cells in order to reduce leukemic cell burden.

We found that even among monocytic leukemic cells THP-1 and U937, there was a differential response to GL-PS. GL-PS only enhanced proliferation of U937, an AML M5 cell-line but could not induce its differentiation into DCs as in THP-1. Contrary to our findings, GL polysaccharides were reported to have to ability in inhibiting the growth of U937 cells, but it was under the influence of a conditioned medium primed by GL polysaccharides-stimulated human blood mononuclear cells [14]. This finding in fact suggested such inhibition required possible soluble factors secreted by the primed monocytes. In a recent report by Muller et al [15], GL was also demonstrated to be anti-proliferative in leukemic cells rather than inducing cell proliferation as shown in our study. This is mainly related to the choice of purified components being used. In our study, purified GL polysaccharides were used whereas purified GL triterpenes such as ganoderic acids were used in Muller et al. study. From the review of literature (see Table I), GL polysaccharides have consistently been shown to have immunological potency and can suppress cancer cell growth mainly by activating host's immune responses. In contrast, the triterpenes exert direct cytotoxic effect mainly through induction of cell cycle arrests and apoptosis in cancer cells including human leukemia, lymphoma and multiple myeloma (HL60, U937, K562, Blin-1, Nalm-6 and RPMI8226) [14,15]; breast cancer cells MDA-MB-231; and umbilical cord vascular endothelial cells HUVEC [16,17]. These data highlighted the importance of the choice of GL components selected for the study. Standardization of polysaccharides and triterpenes contents in the GL products has to be considered if we would like to extend these in vitro data into clinical study.

The GL-PS THP-1 DCs so generated morphologically resembled DCs with upregulated CD11c, HLA-DR, and costimulation molecules CD40, 80 and 86 (Fig. 2). Although the expression levels of these molecules were relatively low when compared with those on normal monocyte-derived DCs, they showed similar DCs function of stimulating allogeneic T cells proliferation responses. They were however immunoregulatory with the evidence of immature uptake of antigens, the IL-10 production as well as low potency in stimulating allogeneic T cell proliferation (Fig. 4, 5, 6). The suppressed T cell proliferation was believed related to their IL-10 production. IL-10 is an immunosuppressive cytokine and renders T cell stop proliferation even under the challenge of allogeneic differences [18]. This is also a mechanism for leukemic cells to escape from immune surveillance by dysregulation of immune systems via secretion of IL-10.

Previous studies demonstrated that GL polysaccharides could induce IL-1 release through the toll-like receptor (TLR)-4 signaling pathways in murine macrophages [19]. This raised a question that whether other TLRs ligands could account for the abnormal cellular responses on monocytic leukemic cells. To test this hypothesis, we also explored the effect of LPS (a ligand of TLR-4) and zymosan (a ligand of TLR-2 and dectin-1) on THP-1 DCs (data not shown). We found that LPS induced more significant cell adhesion to the culture plates and caused more cell death during cell harvesting. This phenomenon was also reported in previous studies but LPS could not induce the maturation of the leukemic DCs [8,9]. For the zymosan treated THP-1, there was no effect in expression of DC maturation markers; dextran-based endocytosis and IL-10, IL-12 productions. But we recognized that the zymosan treated THP-1 DCs with GM-CSF/IL-4 also had decrease potency in stimulating T cells proliferation. This implied that the leukemic cells THP-1 might respond to TLR ligands in different environments such as during infections and lead to abnormal changes.

Conclusion
In summary, we found that GL polysaccharides could induce proliferation of monocytic leukemic cells. Together with GM-CSF/IL-4, GL-PS could induce THP-1 cells to become DCs with significant upregulation of antigen presentation and costimulation molecules expression. The immuno-potent nature was shown by the evidences that they retained ability to uptake antigens with IL-10 productions and decrease in immunostimualtory potential for T cell proliferation. Differential response of monocytic leukemic cells to GL-PS was observed. Our findings thus suggested that GL polysaccharides or other TLR ligands might have clinical impact on patients with monocytic leukemia. Whether GL-PS could induce DCs differentiation from autologous blast cells to help cancer patients to reduce cancer cell burden require further in vivo study for verification.

Materials and methods
Source and preparation of polysaccharides
Purified Ganoderma lucidum polysaccharides (GL-PS) was kindly provided by Prof. Lin ZB (Department of Pharmacology, Peking University Health Science Center, School of Basic Medical Sciences, Beijing, China). It is a polysaccharide peptide from GL mycelium with molecular weight of 584,900 and 17 amino acids. The ratio of polysaccharides to peptides is 93.51%: 6.49%. The polysaccharides consist of glucose, galactose, arabinose, xylose and mannose with molar ratios of 0.793:0.964:2.944:0.167:0.384:7.94 and linked by β-glycosidic linkages [20]. Endotoxin levels in GL-PS were constantly measured by using endotoxin-specific kinetic chromogenic Limulus Ameobyocyte Lysate (LAL) assay kit (Pyrochrome®, Associates of Cape Cod, Inc, East Falmouth, MA) with glucan inhibition buffer (Glucashield®, Associates of Cape Cod) to reconstitute the reagents according to the manufacturer's instructions. Standard curves were generated using Control Standard Endotoxin (CSE) and for better comparison, the LAL reactivity of β-glucan sample was also compared with that of lipopolysaccharide (LPS; Sigma). The endotoxin level of GL-PS was equivalent to 0.01% of 1 ng lipopolysaccharide, LPS, E. coli derived, suggesting negligible.

Cell culture of leukemic cells
Leukemic cells, THP-1 and U937 were purchased from ATCC (Manassas, VA). It was characterized as AML M5. Cells were cultured in medium consisting of 90% RPMI 1640, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin (Invitrogen, Life Technologies, CA) and maintained at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2.

Generation of leukemic DCs in vitro
The generation of leukemic DCs was modified from that for normal Mo-DCs as previously described [11,21]. Leukemic cells THP-1 at the density of 1 × 105 per well were cultured with/without GL-PS (100 μg/mL) in the presence of GM-CSF (40 ng/mL; Novartis Pharma A6, Basle, Switzerland) and IL-4 (40 ng/mL; R&D Systems Inc, Minneapolis, MN) at 37°C under 5% CO2. On Day 3, 90% of the medium was replaced with fresh medium and cytokines. THP-1 DCs were then harvested on Day 5 and washed for further assays. For normal monocyte-derived DCs, mononuclear cells were isolated from buffy coat of healthy adult donors (Red Cross, Hong Kong SAR, China) by Ficoll-Paque Plus density gradient (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Monocytes were then isolated from PBMCs by positive selection using anti-CD14-conjugated magnetic microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). The isolated cells were cultured at a density of 1 × 106 cell/mL in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS, 50 IU/mL penicillin and 50 IU/mL streptomycin (Invitrogen) with GM-CSF and IL-4 at 37°C under 5% CO2 for five days. CD3+ T cells were isolated with the same method except using anti-CD3-conjugated magnetic microbeads (Miltenyi Biotec.). The purity of isolated monocytes was consistently > 85% while that of T cells was consistently > 98% as determined by Coulter Epics Flow Cytometer (Coulter Corporation, Miami, FL). Based on flow cytometry analysis, the immature DCs on Day 5 were 98.3% CD11c+CD1a+ and 99.8% lineage negative (CD3-, CD14-, CD16-, CD19-, CD20-, CD56-).

Cell proliferation assay
The effects of GL-PS on cell proliferation were measured using the Cell Proliferation Kit II XTT assay kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 5 × 104 cells per well were grown in flat-bottom 96-well plates in a final volume of 100 μL culture medium overnight. Cells were then exposed to GL-PS at different concentrations (1 μg/mL to 1 mg/mL) for 24, 48 and 72 h. After the fixed time of incubation, 50 μL of the XTT labeling mixture was added to each well, and incubated for 4 h at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2. The formation of formazan dyes in XTT labeling mixture by metabolically active cells was detected spectrophotometrically at 450 nm. The cell proliferation was calculated from the OD and expressed as percentage of negative control. To confirm the cell proliferation by increase in cell number, trypan blue exclusion assay was performed with trypan blue stain (Invitrogen). A minimum of 300 cells were counted under hemocytometer.

Cell cycle analysis
GL-PS-treated leukemic cells were harvested, washed with PBS, fixed with ice-cold 70% ethanol and stored at 4°C. When for assay, the cell suspensions were incubated with RNase A (100 μg/mL; Sigma) and propidium iodide (4 μg/mL; Sigma) in PBS. Cell cycle phases were then analyzed with Coulter Epics Flow Cytometer (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). The percentage of G1, S and G2/M were determined with Cylchred Version 1.0.2 (Cardiff University, Wales, UK). For the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), we stained the cells with Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated PCNA antibody (BD PharMingen, San Diego, CA) together with isotype control FITC-IgGκ (BD PharMingen). The cell were analyzed with the flow cytometer and the data were analyzed with WINMDI version 2.8 flow cytometry analysis software (Purdue University, West Lafayette, IN).

Flow cytometry analysis of DCs
On Day 5, DCs were harvested, washed and labeled with fluorochrome-conjugated antibodies. After labeling, the cell suspension was washed and resuspended in 300 μL of 1% paraformaldehyde for flow cytometry. Fluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE) and Phycoerthrin-cyanin 5.1 (PC5)-conjugated isotype controls and CD14-PE, CD40-FITC, CD80-FITC, CD86-FITC, CD11c-PE and HLA-DR-PC5 antibodies were purchased from BD PharMingen. Flow cytometric analysis was performed with Coulter Epics Flow cytometer (Beckman Coulter) and analyzed with WINMDI software (Purdue University). To reduce inter-experimental variation, the mean fluorescence intensities for different CD markers were normalized with that of RPMI treated negative control as relative fluorescence intensity.

FITC-dextran endocytosis assay
Leukemic cell-derived and monocyte-derived DCs were harvested and resuspended in RPMI with 10% FBS. FITC-dextran (molecular weight 40 kDa; Sigma) was added at a final concentration of 1 mg/mL. Cells were then incubated at 37°C or 4°C for 1 h. Thereafter, the cells were washed four times with cold PBS and then analyzed with flow cytometer.

ELISA assay for cytokines
The supernatants from DCs cultures were collected after harvesting the cells and stored at -80°C until assayed for cytokines. The levels of IL-12p70 and IL-10 were then measured in duplicate with human Duoset® ELISA Kit (R&D Systems Inc.). The detection ranges for IL-12 and IL-10 were 31.25–2000 pg/mL and 62.5–4000 pg/mL, respectively.

Allogeneic mixed lymphocyte reaction
The leukemic cell-derived and monocyte-derived DCs were irradiated with a gamma-irradiator (Gammacell 1000 Elite, MDS Nordion Inc., Canada) at 30 Gy and co-cultured at the ratio of 1:10 with 1 × 105 allogeneic responder CD3+T cells in flat-bottom 96-well microtiter plates. Bromodeoxyuridine (BrdU) was added into the wells 16 h before the end of five-day culture. Cell proliferation during the last 16 h of the five-day culture was quantified by the Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) kit (Roche Molecular Biochemicals).

Statistical analysis
Comparisons between means were based on nonparametric Student's t test (2-tailed). For more than two groups, we compared the means with one-way ANOVA. The difference was statistically significant when p < 0.05.

Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contributions
WKC designed, performed experiments and wrote up the manuscript; CCC performed experiments, KWL designed the experiments and revised manuscript, YLL provided materials and revised manuscript; GCFC designed, analyzed the data and wrote up the manuscript.

Acknowledgements
This study was supported by the Committee on Research and Conference Grants (CRCG), The University of Hong Kong, Ho-Tung SK Charitable Fund, and Pau K.W. Charitable Fund. We thank Prof. Lin ZB for providing the purified polysaccharides.

References
Copeland DR, Silberberg Y, Pfefferbaum B: Attitudes and practices of families of children in treatment for cancer. A cross-cultural study.
Am J Pediatr Hematol Oncol 1983, 5(1):65-71. PubMed Abstract OpenURL
Kelly KM, Jacobson JS, Kennedy DD, Braudt SM, Mallick M, Weiner MA: Use of unconventional therapies by children with cancer at an urban medical center.
J Pediatr Hematol Oncol 2000, 22(5):412-416. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Sparber A, Wootton JC: Surveys of complementary and alternative medicine: Part II. Use of alternative and complementary cancer therapies.
J Altern Complement Med 2001, 7(3):281-287. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Ramsay NA, Kenny MW, Davies G, Patel JP: Complimentary and alternative medicine use among patients starting warfarin.
Br J Haematol 2005, 130(5):777-780. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Chan G, Mullen P, Ha S, Wong G, Lee T, YL L: Use of alternative medical treatments in paediatric oncology patients in Hong Kong.
Annual Scientific Meeting of the Paediactric Society of Hong Kong 1998. OpenURL
Lin ZB, Zhang HN: Anti-tumor and immunoregulatory activities of Ganoderma lucidum and its possible mechanisms.
Acta Pharmacol Sin 2004, 25(11):1387-1395. PubMed Abstract OpenURL
Wasser SP, Weis AL: Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective.
Crit Rev Immunol 1999, 19(1):65-96. PubMed Abstract OpenURL
Berges C, Naujokat C, Tinapp S, Wieczorek H, Hoh A, Sadeghi M, Opelz G, Daniel V: A cell line model for the differentiation of human dendritic cells.
Biochem Biophys Res Commun 2005, 333(3):896-907. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Kim KD, Choi SC, Noh YW, Kim JW, Paik SG, Yang Y, Kim KI, Lim JS: Impaired responses of leukemic dendritic cells derived from a human myeloid cell line to LPS stimulation.
Exp Mol Med 2006, 38(1):72-84. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Cao LZ, Lin ZB: Regulation on maturation and function of dendritic cells by Ganoderma lucidum polysaccharides.
Immunology letters 2002, 83(3):163-169. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Chan WK, Lam DT, Law HK, Wong WT, Koo MW, Lau AS, Lau YL, Chan GC: Ganoderma lucidum mycelium and spore extracts as natural adjuvants for immunotherapy.
J Altern Complement Med 2005, 11(6):1047-1057. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Lin YL, Liang YC, Lee SS, Chiang BL: Polysaccharide purified from Ganoderma lucidum induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB and p38 mitogen-activated protein kinase pathways.
Journal of leukocyte biology 2005, 78(2):533-543. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Masterson AJ, Sombroek CC, De Gruijl TD, Graus YM, Vliet HJ, Lougheed SM, Eertwegh AJ, Pinedo HM, Scheper RJ: MUTZ-3, a human cell line model for the cytokine-induced differentiation of dendritic cells from CD34+ precursors.
Blood 2002, 100(2):701-703. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Lieu CW, Lee SS, Wang SY: The effect of Ganoderma lucidum on induction of differentiation in leukemic U937 cells.
Anticancer Res 1992, 12(4):1211-1215. PubMed Abstract OpenURL
Muller CI, Kumagai T, O'Kelly J, Seeram NP, Heber D, Koeffler HP: Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia, lymphoma and multiple myeloma cells.
Leuk Res 2006, 30(7):841-848. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Lu QY, Sartippour MR, Brooks MN, Zhang Q, Hardy M, Go VL, Li FP, Heber D: Ganoderma lucidum spore extract inhibits endothelial and breast cancer cells in vitro.
Oncol Rep 2004, 12(3):659-662. PubMed Abstract OpenURL
Sliva D, Sedlak M, Slivova V, Valachovicova T, Lloyd FP Jr, Ho NW: Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human breast and prostate cancer cells.
J Altern Complement Med 2003, 9(4):491-497. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Buggins AG, Milojkovic D, Arno MJ, Lea NC, Mufti GJ, Thomas NS, Hirst WJ: Microenvironment produced by acute myeloid leukemia cells prevents T cell activation and proliferation by inhibition of NF-kappaB, c-Myc, and pRb pathways.
J Immunol 2001, 167(10):6021-6030. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Hsu HY, Hua KF, Lin CC, Lin CH, Hsu J, Wong CH: Extract of Reishi polysaccharides induces cytokine expression via TLR4-modulated protein kinase signaling pathways.
J Immunol 2004, 173(10):5989-5999. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Shao BM, Dai H, Xu W, Lin ZB, Gao XM: Immune receptors for polysaccharides from Ganoderma lucidum.
Biochem Biophys Res Commun 2004, 323(1):133-141. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL
Liu E, Law HK, Lau YL: BCG promotes cord blood monocyte-derived dendritic cell maturation with nuclear Rel-B up-regulation and cytosolic I kappa B alpha and beta degradation.
Pediatric research 2003, 54(1):105-112. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

Προηγούμενες μελέτες απέδειξαν πολυσακχαρίτες Ganoderma lucidum (GL-PS), μια μορφή της βιοδραστικής β-γλυκάνη μπορεί να διεγείρει την ωρίμανση των που προέρχονται από μονοκύτταρα δενδριτικά κύτταρα (DC). Το ζήτημα των ερεθισμάτων πόσο λευχαιμικών κυττάρων ειδικά σε μονοκυτταρική γράμμωσης ανταποκρίνονται σε GL-PS παραμένει ασαφής.

αποτελέσματα
Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το in vitro μοντέλο καλλιέργειας με λευχαιμικά μονοκυτταρικές κυτταρικές γραμμές ΤΗΡ-1 και U937 ως μονοκυτταρικά κύτταρα τελεστές για αποκρίσεις πολλαπλασιασμού και επαγωγή ΑΧ. Εμείς αντιμετωπίζονται τα κύτταρα ΤΗΡ-1 και U937 με καθαρισμένη GL-PS (100 μg / mL) ή GL-PS με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4. GL-PS μόνο διήγειρε πολλαπλασιαστική απόκριση στις δύο ΤΗΡ-1 και U937 κύτταρα, αλλά μόνο ΤΗΡ-1 μετασχηματίζεται σε τυπική μορφολογία DC όταν διεγείρονται με GL-PS συν ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4. Το μετασχηματισμένο ΤΗΡ-1 DCs είχαν σημαντική αύξηση της έκφρασης HLA-DR, CD40, CD80 και CD86 αν και δεν είναι τόσο υψηλές όσο η έκταση της κανονικής προερχόμενα από μονοκύτταρα δενδριτικά κύτταρα. Είχαν παρόμοια ικανότητα αντιγόνου-πρόσληψης ως κανονική προερχόμενα από μονοκύτταρα δενδριτικά θετικός έλεγχος. Ωστόσο, η ισχύς τους στην επαγωγή πολλαπλασιασμού αλλογενή Τ κυττάρων ήταν επίσης μικρότερη από εκείνη των κανονικών προερχόμενα από μονοκύτταρα δενδριτικά κύτταρα.

συμπέρασμα
Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι GL-PS θα μπορούσε να προκαλέσει επιλεγμένα μονοκυτταρική λευχαιμικών διαφοροποίηση των κυττάρων σε δενδριτικά κύτταρα με ανοσο-διεγερτικές λειτουργία. Η πιθανή κλινική επίπτωση της χρήσης αυτής που χρησιμοποιούνται συνήθως φαρμακευτικών μανιταριών σε ασθενείς με μονοκυτταρική λευχαιμία (AML-Μ4 και Μ5) άξιζε περαιτέρω έρευνα.

φόντο
Σε τόσο στη Δυτική όσο και Ανατολικών κοινωνιών, ασθενείς με καρκίνο που συνήθως λαμβάνουν συμπληρωματική και εναλλακτική ιατρική, ενώ είχαν υποβληθεί σε συμβατική θεραπεία κατά του καρκίνου [1-3]. Μεταξύ των διαφόρων ειδών της εναλλακτικής ιατρικής, φυτικό φάρμακο είναι η πιο δημοφιλής μορφή που λαμβάνονται από ασθενείς στο Ηνωμένο Βασίλειο [4]. Στην κοινότητά μας, περισσότερο από το 42% των ασθενών μας παιδιατρικό καρκίνο πήρε φυτικό φάρμακο, όταν έλαβαν τη συμβατική χημειοθεραπεία [5]. Ανάμεσά τους, η συχνότερη βότανο που χρησιμοποιείται είναι τα αποσπάσματα που προέρχονται από Ganoderma lucidum.

Ganoderma lucidum (GL) είναι μια παραδοσιακή κινεζική ιατρική είναι γνωστή από τους μη ειδικούς ως «βότανο της αθανασίας». Είχε χρησιμοποιηθεί ως τονωτικό για την υγεία για να προωθήσει τη μακροζωία για περισσότερο από δύο χιλιάδες χρόνια. Διαθέτει δύο μεγάλες ομάδες βιοενεργών συστατικών: πολυσακχαρίτες και triterpenes. Στην πρόσφατη δεκαετία, έχουν μελετηθεί εκτενώς, λόγω των δυνητικών ανοσορυθμιστική και αντι-όγκου αποτελέσματά της, όπως αποδείχθηκε σε in vitro και in vivo μοντέλα [6]. Μέχρι τώρα, αυτή τη στιγμή διαθέσιμα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η GL πολυσακχαρίτες ασκούν καθήκοντα κατά του καρκίνου έμμεσα με την ενεργοποίηση των ανοσολογικών αποκρίσεων υποδοχής, ενώ GL τριτερπένια μπορεί να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα απευθείας μέσω ευθεία κυτταροτοξική δράση της [7]. Οι GL πολυσακχαρίτες καθαριστεί από το μανιτάρι μυκήλιο και περιέχουν διακλαδισμένης β-γλυκάνη.

Τα δενδριτικά κύτταρα (DC) είναι το πιο ισχυρό αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και έχουν μοναδική ικανότητα στη σύνδεση έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία. Λόγω της σπανιότητας των κυκλοφορούντων ΔΚ, το πρωτόκολλο για τη μελέτη της βιολογίας και της ΑΧ διαφοροποίηση είναι κυρίως μέσω της διαφοροποίησης των μονοκυττάρων σε ΑΧ με τις κυτοκίνες GM-CSF και IL-4. Πρόσφατα, δενδριτικά κύτταρα μπορεί να επάγεται από την οξεία μυελογενή λευχαιμικά κύτταρα (AML) και αυτό εγείρει τη δυνατότητα χρησιμοποίησης DCs προέρχονται από αυτόλογα λευχαιμικά κύτταρα για θεραπευτικές χρήσεις [8]. Αρκετές κυτταρικές σειρές AML συμπεριλαμβανομένων μονοκυτταρική ΤΗΡ-1, KG-1 και CD34 + MUTZ3 κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί ως κυτταρικά μοντέλα για τη μελέτη της διαφοροποίησης των λευχαιμικών κυττάρων και των DCs βιολογίας. Ωστόσο, τα πρωτόκολλα διαφοροποίησης διέφεραν σε μεγάλο βαθμό. Για παράδειγμα, ώριμα δενδριτικά κύτταρα θα μπορούσαν να προέρχονται μόνον από ΤΗΡ-1 και KG-1 με προσθήκη GM-CSF και IL-4 μαζί με ιονομυκίνη και ΤΝΡ-α [8]. Είναι ενδιαφέρον, όλες μελέτη συμφώνησαν ότι υπάρχει μειωμένη ανταπόκριση των λευχαιμικών DC σε LPS σκηνοθεσία ΑΧ ωρίμανσης [9]. Αυτό υποδηλώνει ότι αυτές οι λευχαιμικά ΑΧ είναι κάπως ελαττωματικό σε απόκριση στην ωρίμανση ερεθίσματα.

Εμείς και άλλες ομάδες κατέδειξαν GL πολυσακχαρίτες μυκήλιο έχουν την ικανότητα να διεγείρει την ωρίμανση των ανθρώπινων DCs [10-12]. Ενώ οι περισσότερες αναφορές που υποστηρίζουν το ρόλο ανοσορυθμιστική του GL για κανονική μονοκύτταρα, τα δεδομένα μας παρέχεται μια νέα παρατήρηση ότι GL πολυσακχαρίτες μπορεί επίσης να ενισχύσει μονοκυτταρική πολλαπλασιασμό λευχαιμικών κυττάρων και επάγει την διαφοροποίηση δενδριτικών κυττάρων από μονοκυτταρική λευχαιμικών βλαστών. Η συνειδητοποίηση του φαινομένου αυτού μπορεί να μας βοηθήσει να σχεδιάσουμε ειδική θεραπευτική προσέγγιση για μονοκυτταρική λευχαιμία.

αποτελέσματα
Απόκριση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ΤΗΡ-1 μετά από GL πολυσακχαρίτες διέγερση
Να αναμεταδώσει το GL-PS έχει επίδραση επί λευχαιμικά κύτταρα, αξιολογήσαμε την επίδραση της GL πολυσακχαρίτες (GL-PS) σχετικά με την οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) κυτταρικές σειρές ΤΗΡ-1 και U937 με δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού. GL-PS μόνη σε δόση των 100 μg / ml θα μπορούσε να διεγείρει την ανάπτυξη των δύο ΤΗΡ-1 και U937 κύτταρα. Οι μέσες αυξήσεις μετά την έκθεση τριών ημερών σε ΤΗΡ-1 και U937 κύτταρα ήταν 1,53 φορές και 1,16 φορές υψηλότερη από ό, τι το μη επεξεργασμένο έλεγχο, αντιστοίχως (Εικ. 1Α). Βινκριστίνη, ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για να δείξει τα κύτταρα να ανταποκρίνεται. Η ανάλυση κύκλου κυττάρου με χρώση ΡΙ έδειξε ότι GL-PS δεν προκάλεσε τη σύλληψη φάσης S κατά τη διάρκεια των θεραπειών τριών ημερών (Σχήμα 1Β). Ελέγχοντας την έκφραση του πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), το οποίο είναι ένα δείκτης S-φάσης, τόσο ΤΗΡ-1 και U937 κύτταρα παρουσίασαν αυξήσεις στην έκφραση PCNA μετά από θεραπεία GL-PS (Σχ. 1C).

thumbnailFigure 1. (Α) Leukemic πολλαπλασιασμό των κυττάρων που επάγεται από GL πολυσακχαρίτες. Οι καμπύλες χρόνου-απόκρισης για την επίδραση του GL πολυσακχαρίτες (GL-PS, - ▪ -) στα 100 μg / mL και βινκριστίνη (- ▫ -) σε 0,1 μΜ για την ΤΗΡ-1 (αριστερό πάνελ) και U937 κύτταρα (δεξί πάνελ) προσδιορίζεται με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου ΧΤΤ. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριπλών καλλιεργειών των τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων. * ρ <0.05? ** Ρ <0.01? *** p <0,001 έναντι του αρνητικού μάρτυρα (- • -). (Β) ανάλυση του κύκλου κυττάρων με χρώση ΡΙ. Η ΤΗΡ-1 (αριστερό πάνελ) και U937 κύτταρα (δεξί πάνελ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 100 μg / mL GL-PS για τρεις ημέρες. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου στη συνέχεια αναλύθηκαν με χρώση ΡΙ και Cylchred Έκδοση 1.0.2 (Cardiff University, Ουαλία, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα αποτελέσματα που εμφανίζονται ήσαν από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν. (C) έκφραση PCNA του GL-PS κατεργασία ΤΗΡ-1 (άνω πάνελ) και κύτταρα U937 (κατώτερο πάνελ) σε επώαση τριών ημερών. Τα αποτελέσματα που εμφανίζονται ήσαν από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν.
Επαγωγή της ΑΧ-όπως μορφολογία και φαινοτύπου σε GL-PS κατεργασία ΤΗΡ-1 κύτταρα
Υπό θεραπεία GL-PS (100 μg / mL χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα και μετά), παρατηρήσαμε DC-όπως μορφολογία σε καλλιέργεια κυττάρων ΤΗΡ-1. Δεδομένου ότι εκθέσεις δείχνουν ότι ΤΗΡ-1 μπορεί να διεγείρεται σε DC από έναν συνδυασμό κυτταροκινών [8,13], υποθέσαμε ότι GL-PS μπορεί επίσης να επάγει ή να ενισχύσει τη διαφοροποίηση των ΤΗΡ-1 κυττάρων σε ΤΗΡ-1 ΑΧ. Καλλιεργήσαμε αυτά τα κύτταρα με την παρουσία του ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 με ή χωρίς GL-PS. Χρησιμοποιήσαμε Μο-DCs ως θετικός έλεγχος και μη επεξεργασμένα κύτταρα ΤΗΡ-1 ως αρνητικός έλεγχος. ΤΗΡ-1 κατεργάστηκε με GL-PS συν ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 απέδωσε άτυπα μεγάλες προσκολλητικά και επιμήκη κύτταρα με πολλαπλά κυτταροπλασματικά αιχμές (λευκό βέλος) σε σύγκριση με το γύρο κυμαινόμενο ΤΗΡ-1 κύτταρα και τυπικά Μο-DCs με πολλαπλές δορυφόρου παρόμοια κυτταροπλασματικές προεξοχές (Σχ. 2Α). Σύμφωνα με την ανάλυση προς τα εμπρός και την πλευρά της διασποράς κυτταρομετρία ροής (κάτω πάνελ), διαπιστώσαμε ότι τα ΤΗΡ-1 ΔΚ, προερχόμενων με GL-PS (GL-PS THP-1 ΑΧ) είχαν μεγαλύτερο μέγεθος σαν τα μονοκύτταρα όταν διαφοροποιούνται σε δενδριτικά κύτταρα. Για τα κύτταρα U937, δεν παρατηρήσαμε παρόμοια μορφολογικές αλλαγές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

thumbnailFigure 2. δενδριτικά κύτταρα που μοιάζουν με φαινότυπο της ΤΗΡ-1 που προκαλείται από GL-PS και ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4. (Α) Μικροσκοπική μορφολογία των κανονικών ώριμης προερχόμενα από μονοκύτταρα δενδριτικά (Μο-mDCs) και ΤΗΡ-1 DCs (άνω πάνελ). Τα στρογγυλά κύτταρα ΤΗΡ-1 να αλλάξει προσφύσεως ισοπεδώσουν κύτταρα (λευκά βέλη). Υπό τα εμπρός σκέδαση και την πλευρά ανάλυσης διασποράς κυτταρόμετρο ροής (κατώτερο πάνελ), τα ΤΗΡ-1 DCs αυξήθηκαν σε μέγεθος όταν συγκρίνεται με ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο. (Β) Η επιφανειακή έκφραση της παρουσίασης αντιγόνου και μορίων συνδιέγερσης για ανώριμα Μο-DCs (Μο-iDCs), ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο, ΤΗΡ-1 διεγέρθηκαν με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4? GL-PS κατεργασία ΤΗΡ-1, ΤΗΡ-1 διεγείρεται με αμφότερα GL-PS και ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4. Οι εκφράσεις DC δείκτες ωρίμανσης CD11c, HLA-DR, CD40, CD80 και CD86 σε DCs αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής μετά τη διαφοροποίηση των πέντε ημερών. Τα αποτελέσματα που εμφανίζονται ήσαν από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τριπλούν ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται. (Γ) Η μέση σχετική έκφραση των δεικτών ωρίμανσης DC. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων. * ρ <0.05? ** Ρ <0.01? *** ρ <0.001 έναντι αυτής των ΤΗΡ-1 κύτταρα.
Η φαινοτυπική ωρίμανση των ΤΗΡ-1 ΔΚ, προερχόμενων με GL-PS
Στη συνέχεια ελέγχεται η επιφανειακή έκφραση των μορίων παρουσίασης του αντιγόνου και τα μόρια συνδιέγερσης, το οποίο Μο-ΑΧ κανονικά εκφράζουν. Στο ΣΧ. 2Β, βρήκαμε ότι η ΤΗΡ-1 που εκφράζεται σχετικώς χαμηλά επίπεδα CD11c, HLA-DR, CD40, CD80 και CD86 σε σύγκριση με την κανονική Μο-ΑΧ. Πρόκληση της ΤΗΡ-1 με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 και GL-PS έδειξαν αύξηση σε όλους τους δείκτες, όταν συγκρίθηκε με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ΤΗΡ-1. Να ελέγχουν την πειραματική συνέπειας, μπορούμε στη συνέχεια κανονικοποιείται την ένταση φθορισμού από τέσσερα πειράματα που χρησιμοποιούν την έκφραση δείκτη CD σε ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο ως το 100% (Εικ. 2C). GL-PS μόνο θα μπορούσε να επάγει σημαντική αύξηση CD11c, HLA-DR και CD40 σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο κύτταρα ΤΗΡ-1 και μόνο. Αλλά μαζί με την κυτοκίνη, η GL-PS THP-1 ΑΧ παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε όλες τις πέντε CD εκφράσεις δείκτη, γεγονός που υποδηλώνει φαινοτυπική ωριμότητα. Η ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 μόνο δεν αυξάνει πάντα την έκφραση δείκτη ωρίμανσης σε ΤΗΡ-1. Για να δείξει την ειδικότητα του DC διαφοροποίησης σε κύτταρα ΤΗΡ-1, επαναλάβαμε τα πειράματα σε κύτταρα U937. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική αύξηση σε όλα τα DCs δείκτες ωρίμανσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Απώλεια κυτταρικής απόκρισης πολλαπλασιασμού μετά προστίθεται με κυτοκίνες
Για να δείξει τη δέσμευση διαφοροποίηση των GL-PS κατεργασία ΤΗΡ-1 κύτταρα παρουσία του ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4, προσθέσαμε ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 στα κύτταρα ΤΗΡ-1, η οποία είχε υποστεί επεξεργασία με GL-PS για τρεις ημέρες. Παρακολουθήσαμε την κυτταρική ανάπτυξη για δύο ακόμη ημέρες (Ημέρα 4 και 5) με δοκιμασίες πολλαπλασιασμού ΧΤΤ (Εικ. 3Α). Προσθέτοντας ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 επάγεται σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό σε GL-PS κατεργασία ΤΗΡ-1 την ημέρα 4. Εντούτοις, ο πολλαπλασιασμός έγινε στατική μετά την Ημέρα 5. Επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματα πολλαπλασιασμού κυττάρων με κυτταρικές καταμέτρηση χρησιμοποιώντας trypan δοκιμασία αποκλεισμού του μπλε. Όπως φαίνεται στο Σχ.. 3Β, καταγράψαμε σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων όταν είτε ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 ή GL-PS προστέθηκαν στα κύτταρα ΤΗΡ-1 την Ημέρα 5. Όταν προστέθηκαν τόσο GL-PS και ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4, ο αριθμός των κυττάρων που διατηρούνται είναι παρόμοια με την αρνητική χωρίς θεραπεία ΤΗΡ-1. Η μείωση δεν οφειλόταν στο θάνατο του κυττάρου όπως υποδεικνύεται από το μπλε της τρυπάνης χρώση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

thumbnailFigure 3. ικανότητα διάδοσης των ΤΗΡ-1 κύτταρα κατεργασμένα με GL-PS μετά την προσθήκη ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4. (Α) Επίδραση της προσθήκης ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 προς ΤΗΡ-1 μετά από τρεις-ημερών θεραπεία της GL-PS όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΧΤΤ. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων. * ρ <0.05? ** Ρ <0.01? *** p <0,001 έναντι ότι χωρίς ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 πρόσθεσε. (Β) ΤΓγρβη δοκιμασία αποκλεισμού του μπλε. ΤΗΡ-1 κύτταρα μετά από την προσθήκη είτε ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 ή GL-PS μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων. * ρ <0.05? ** Ρ <0.01? *** ρ <0.001 έναντι αυτής των ΤΗΡ-1 κύτταρα.
Αυξορρυθμισμένη ενδοκυτοτική δραστηριότητα των ΤΗΡ-1 ΔΚ, προερχόμενων με GL-PS
Εξετάσαμε την ενδοκυτταρική δραστικότητα των ΤΗΡ-1 DCs χρησιμοποιώντας φθορίζον επισημασμένο FITC-δεξτράνης ως αντιγόνα και επωάστηκαν τους στους 37 ° C. Χρησιμοποιήσαμε PBS ως αρνητικός έλεγχος, καθώς και παράλληλα πειράματα στους 4 ° C για να χρησιμεύσει ως το φθορισμό φόντου. Βρήκαμε ότι η ΤΗΡ-1, ΤΗΡ-1 DCs με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 και ΤΗΡ-1 με GL-PS έδειξε παρόμοια ικανότητα πρόσληψης αντιγόνου (Σχ. 4Α). Για την GL-PS ΤΗΡ-1 DCs, έχουμε αναπάντεχα βρει ότι υπήρχε μια αύξηση στην πρόσληψη σήματα αντιγόνου από το ΡΙΤΟ-δεξτράνης μετά την κανονικοποίηση με τον αρνητικό μάρτυρα (Εικ. 4Β). Προκειμένου να αποκλείσει το ενδεχόμενο της προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα μαννόζης, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την πρόσληψη της ΡΙΤΟ-δεξτράνης, προσδιορίσαμε το επίπεδο έκφρασης του υποδοχέα μαννόζης και βρήκαμε δεν παρατηρήθηκε μεταβολή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

thumbnailFigure 4. Ενδοκυττάρωση ΡΙΤΟ-δεξτράνη με ΤΗΡ-1 κύτταρα και ΤΗΡ-1 ΑΧ. (Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία DCs επωάστηκαν με FITC-δεξτράνης για 1 ώρα στους 37 ° C και στη συνέχεια πλύθηκε για τέσσερις φορές. Αυξάνουν μετατόπιση στην ένταση φθορισμού (άξονας χ) συγκρίθηκε με τον έλεγχο, το ένα χωρίς ΡΙΤΟ-δεξτράνη. Το αποτέλεσμα ήταν από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων. (Β) Η αύξηση στην ένταση φθορισμού υπολογίστηκε σε σύγκριση με εκείνη των ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο μετά κανονικοποιείται με το φθορισμό υποβάθρου, η οποία ήταν από τις παράλληλες πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για όλα τα κύτταρα στους 4 ° C. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** Ρ <0.01 έναντι αυτής των ΤΗΡ-1 κύτταρα.
Χαμηλή IL-12 και IL-10 της παραγωγής σε ΤΗΡ-1 DCs προέρχονται με GL-PS
Ανιχνεύσαμε χαμηλή ποσότητα IL-12 παραγωγή από κύτταρα ΤΗΡ-1, ΤΗΡ-1 DCs με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4, ΤΗΡ-1 με GL-PS και GL-PS ΤΗΡ-1 δενδριτικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Αν και ΤΗΡ-1 DCs με ή χωρίς GL-PS είχαν σχετικώς υψηλότερη παραγωγή IL-12, η ποσότητα δεν ήταν σημαντική. Σε αντίθεση, GL-PS ΤΗΡ-1 DCs παρουσίασαν σημαντική αύξηση στην παραγωγή IL-10 (Σχήμα 5Β).

thumbnailFigure 5. (Α) IL-12p70 και (Β) IL-10 παραγωγές από ΤΗΡ-1 με και χωρίς ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 ή GL-PS. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με ELISA εις διπλούν. Η ανίχνευση κυμαίνεται για την IL-12 και IL-10 ήταν 31,25 έως 2000 pg / mL και 62,5 - 4.000 pg / ml, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα για την IL-12 και τρία ανεξάρτητα πειράματα για την IL-10. *** ρ <0.001 έναντι αυτής των ΤΗΡ-1 κύτταρα.
Μείωση σε πολλαπλασιασμό Τ κυττάρου σε αλλογενή μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση
Προσδιορίσαμε την έκβαση αυτών των ΤΗΡ-1 DCs όταν συν-καλλιεργήθηκαν με φυσιολογική CD3 + Τ κύτταρα, με ανώριμα και ώριμα δενδριτικά κύτταρα Μο-ως θετικός έλεγχος. Σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ που επάγεται από ανώριμα DCs να ωριμάσει (Σχήμα 6Α, αριστερά). Είναι ενδιαφέρον, διαπιστώσαμε ότι υπήρχε μια καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων στην συν-καλλιέργεια του GL-PS ΤΗΡ-1 DCs σε σύγκριση με άλλα κύτταρα ΤΗΡ-1 ή ΤΗΡ-1 δενδριτικά κύτταρα (Σχήμα 6Α, αριστερά). Όταν συγκρίνονται με κύτταρα ΤΗΡ-1 και μόνο, GL-PS ΤΗΡ-1 DCs έδειξαν σημαντική μείωση σε πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων (Σχήμα 6Α, δεξιά). Στη συνέχεια εξετάστηκε η καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων δεν οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η καταστολή δεν επικεντρώνονται επί των Τ βοηθητικών κυττάρων CD4 + και CD8 + κυτταροτοξικά Τ κύτταρα υποδεικνύεται από καμία σημαντική αλλαγή στην αναλογία CD4/CD8 + (Σχ. 6Β).

. thumbnailFigure 6 (Α) Αλλογενής μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση της κανονικής ώριμης Μο-DCs (-ο-)? ανώριμα Μο-δενδριτικά κύτταρα (-r-)? ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο (- ▲ -)? ΤΗΡ-1 κυττάρων με GL-PS (- ○ -)? ΤΗΡ-1 DCs (- ▪ -) και GL-PS ΤΗΡ-1 DCs (- ● -) με CD3 + Τ κύτταρα σε αναλογία 1:10 και 1:100 Οι οπτικές πυκνότητες των BrdU ενσωματώθηκε από DC:. Τ συν-καλλιέργειες κανονικοποιήθηκαν με αυτό από Τ κύτταρα μόνο. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται ένα πειραματικό αποτέλεσμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * ρ <0.05 έναντι αυτής των ΤΗΡ-1 κύτταρα μόνο. (Β) αναλογία CD4/CD8 των συν-καλλιεργημένα Τ κύτταρα. Οι συν-καλλιεργημένα Τ κύτταρα συγκομίζονται έτσι βάφτηκαν με CD4 και CD8 αντίσωμα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται τη μέση τιμή ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα. ** ρ <0.01 έναντι αυτής και μόνο των Τ κυττάρων.
συζήτηση
Αποδείξαμε ενταύθα ότι καθαρισμένα πολυσακχαρίτες ανοσοδιαμορφωτικό GL, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως επικουρική θεραπεία για σκοπούς αντι-όγκου, θα μπορούσε να επάγει τόσο την μονοκυτταρική λευχαιμική πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ανώμαλη κυτταρική διαφοροποίηση σε μορφή ανοσορυθμιστικών ΑΧ. Είναι ενδιαφέρον, όπως πολλαπλασιαστική διέγερση δεν βρέθηκε σε άλλους μη μονοκυτταρικής λεμφοειδείς και μυελοειδείς λευχαιμικές κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας τέτοιο αποτέλεσμα ήταν γράμμωσης ειδικά. Διερευνήσαμε επίσης τη δυνατότητα χρησιμοποίησης GL-PS να επάγουν DCs από αυτόλογα βλαστικά κύτταρα προκειμένου να μειωθεί λευχαιμικών κυττάρων επιβάρυνση.

Βρήκαμε ότι ακόμα και μεταξύ μονοκυτταρικά λευχαιμικά κύτταρα ΤΗΡ-1 και U937, υπήρξε μια διαφορική απόκριση σε GL-PS. GL-PS μόνο ενίσχυσε τον πολλαπλασιασμό του U937, μια κυτταρική γραμμή AML M5, αλλά δεν θα μπορούσε να προκαλέσει διαφοροποίηση του σε δενδριτικά κύτταρα, όπως σε ΤΗΡ-1. Αντίθετα με τα ευρήματά μας, GL πολυσακχαρίτες αναφέρθηκαν για να έχουν την ικανότητα στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων U937, αλλά ήταν κάτω από την επίδραση ενός ρυθμισμένου μέσου γεμάτοι από GL ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος πολυσακχαρίτες διεγείρεται [14]. Αυτό το εύρημα προτείνει, πράγματι τέτοια αναστολή απαιτούνται δυνατή διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα μονοκύτταρα γεμάτοι. Σε μια πρόσφατη έκθεση από Muller et αϊ [15], GL καταδείχθηκε επίσης να είναι αντι-πολλαπλασιαστικά σε λευχαιμικά κύτταρα παρά την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, όπως φαίνεται στη μελέτη μας. Αυτό είναι κυρίως με την επιλογή των καθαρισμένων συστατικών που χρησιμοποιούνται. Στη μελέτη μας, καθαρισμένη GL πολυσακχαρίτες χρησιμοποιήθηκαν ενώ καθαρισμένα τριτερπένια GL όπως ganoderic οξέα χρησιμοποιήθηκαν σε Muller et αϊ. μελέτη. Από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας (βλέπε Πίνακα Ι), GL πολυσακχαρίτες έχουν σταθερά έχει αποδειχθεί ότι έχουν ανοσολογική δραστικότητα και μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου, κυρίως με την ενεργοποίηση ανοσοαποκρίσεων ξενιστή. Σε αντίθεση, τα τριτερπένια ασκούν άμεσο κυτταροτοξικό αποτέλεσμα, κυρίως μέσω επαγωγής των συλλήψεων του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ανθρώπινη λευχαιμία, το λέμφωμα και το πολλαπλό μυέλωμα (HL60, U937, Κ562, Blin-1, ΝθΙπί-Θ 6 και RPMI8226) [14,15 ]? κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-MB-231? και τον ομφάλιο λώρο των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC [16,17]. Αυτά τα δεδομένα τόνισαν τη σημασία της επιλογής των συστατικών GL επιλέχθηκαν για τη μελέτη. Τυποποίηση των πολυσακχαριτών και triterpenes περιεχόμενο στα προϊόντα GL πρέπει να εξεταστεί αν θα θέλαμε να επεκτείνει αυτά τα in vitro δεδομένα σε κλινική μελέτη.

GL-PS ΤΗΡ-1 ΑΧ έτσι δημιουργούνται μορφολογικά έμοιαζε DCs με αυξητικά CD11c, HLA-DR, και τα μόρια συνδιέγερσης CD40, 80 και 86 (Σχ. 2). Αν και τα επίπεδα έκφρασης αυτών των μορίων ήταν σχετικά χαμηλή σε σύγκριση με εκείνα σε κανονικό προερχόμενα από μονοκύτταρα δενδριτικά, έδειξαν παρόμοια DCs λειτουργία της διέγερσης αλλογενή Τ αποκρίσεις πολλαπλασιασμού κυττάρων. Είχαν όμως ανοσορυθμιστικό με τα στοιχεία των ανώριμων πρόσληψης αντιγόνων, την παραγωγή IL-10, καθώς και χαμηλή δραστικότητα στη διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αλλογενή Τ (Εικ. 4, 5, 6). Η κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό Τ κυττάρου πιστεύεται σχετίζονται με IL-10 της παραγωγής τους. IL-10 είναι μια ανοσοκατασταλτική κυτοκίνη και καθιστά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ στάση ακόμη και κάτω από την πρόκληση της αλλογενών διαφορές [18]. Αυτό είναι επίσης ένας μηχανισμός για την λευχαιμικά κύτταρα να ξεφύγουν από την ανοσολογική επιτήρηση από δυσ-ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω της έκκρισης της IL-10.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι GL πολυσακχαρίτες θα μπορούσε να προκαλέσει IL-1 απελευθέρωσης μέσω της Toll-like υποδοχείς (TLR) -4 σηματοδότηση μονοπατιών σε μακροφάγα ποντικού [19]. Αυτό θέτει ένα ερώτημα ότι αν άλλους συνδετήρες TLRs θα μπορούσε να εξηγήσει τις ανώμαλες κυτταρικές αποκρίσεις σε μονοκυτταρική λευχαιμικών κυττάρων. Για να δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση, διερευνήσαμε επίσης την επίδραση του LPS (ένας συνδέτης του TLR-4) και ζυμοζάνη (ένας συνδέτης του TLR-2 και dectin-1) επί ΤΗΡ-1 δενδριτικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Βρήκαμε ότι το LPS επαγόμενη πιο σημαντική προσκόλληση των κυττάρων στις πλάκες καλλιέργειας και προκάλεσε περισσότερο κυτταρικού θανάτου κατά τη διάρκεια της κυτταρικής συγκομιδής. Το φαινόμενο αυτό, επίσης, αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες, αλλά LPS δεν θα μπορούσε να επάγει την ωρίμανση των λευχαιμικών ΑΧ [8,9]. Για την αγωγή ζυμοζάνη ΤΗΡ-1, δεν υπήρχε επίδραση στην έκφραση του DC δεικτών ωρίμανσης? ενδοκυττάρωση δεξτράνη βάση και IL-10, IL-12 παραγωγές. Αλλά αναγνώρισε ότι η zymosan αντιμετωπίζονται THP-1 ΑΧ με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4 είχε επίσης μείωση της ισχύος στη διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Τ. Αυτό σήμαινε ότι τα λευχαιμικά κύτταρα ΤΗΡ-1 μπορεί να ανταποκριθεί σε TLR συνδέτες σε διαφορετικά περιβάλλοντα, όπως κατά τη διάρκεια μολύνσεων και να οδηγήσει σε μη φυσιολογικές αλλαγές.

συμπέρασμα
Εν περιλήψει, βρήκαμε ότι GL πολυσακχαρίτες θα μπορούσαν να επάγουν τον πολλαπλασιασμό των λευχαιμικών κυττάρων μονοκυτταρικού. Μαζί με ΟΜ-ΟδΡ/Ιί-4, GL-PS μπορούσε να επάγει ΤΗΡ-1 κύτταρα για να γίνει DCs με σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της παρουσίασης του αντιγόνου και την έκφραση μορίων συνδιέγερσης. Η ανοσο-ισχυρός φύση δείχθηκε από τις αποδείξεις ότι διατήρησαν την ικανότητα να προσλαμβάνει τα αντιγόνα με την IL-10 και να μειώσει παραγωγές σε immunostimualtory δυναμικό για πολλαπλασιασμό Τ κυττάρου. Διαφορική απόκριση μονοκυτταρικών λευχαιμικών κυττάρων σε GL-PS παρατηρήθηκε. Τα ευρήματά μας έτσι πρότεινε ότι GL πολυσακχαρίτες ή άλλους συνδέσμους TLR μπορεί να έχουν κλινική σημασία σε ασθενείς με μονοκυτταρική λευχαιμία. Είτε GL-PS θα μπορούσε να προκαλέσει ΑΧ διαφοροποίηση από αυτόλογα βλαστικά κύτταρα για να βοηθήσει τους ασθενείς με καρκίνο να μειώσει κυττάρων άχθος του καρκίνου απαιτούν περαιτέρω in vivo μελέτη για επαλήθευση.

Υλικά και μέθοδοι
Πηγή και την προετοιμασία των πολυσακχαριτών
Τα καθαρισμένα πολυσακχαρίτες Ganoderma lucidum (GL-PS) είναι ευγενική παραχώρηση από τον καθηγητή Lin ZB (Τμήμα Φαρμακολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Health Science Center, Τμήμα Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα). Είναι ένα πεπτίδιο πολυσακχαρίτη από GL μυκηλίου με μοριακό βάρος 584.900 και 17 αμινοξέα. Η αναλογία των πολυσακχαριτών σε πεπτίδια είναι 93,51%: 6,49%. Οι πολυσακχαρίτες αποτελούνται από γλυκόζη, γαλακτόζη, αραβινόζη, ξυλόζη, μαννόζη με μοριακές αναλογίες 0.793:0.964:2.944:0.167:0.384:7.94 και συνδέονται με β-γλυκοσιδικών δεσμών [20]. Επίπεδα ενδοτοξίνης στην GL-PS ήταν συνεχώς μετρήθηκαν με κινητική Limulus Ameobyocyte Lysate (LAL) σετ χρωμογόνο δοκιμασία ενδοτοξίνη ειδική (Pyrochrome ®, Associates of Cape Cod, Inc, East Falmouth, ΜΑ) με γλυκάνη ρυθμιστικό αναστολής (Glucashield ®, Συνεργάτες cape Cod) για την ανασύσταση των αντιδραστηρίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν χρησιμοποιώντας Ελέγχου προτύπου ενδοτοξίνης (CSE) και για την καλύτερη σύγκριση, η αντιδραστικότητα LAL της β-γλυκάνης δείγμα συγκρίθηκε επίσης με εκείνη του λιποπολυσακχαρίτη (LPS? Sigma). Το επίπεδο ενδοτοξίνης του GL-PS ήταν ισοδύναμη με 0,01% από 1 ng λιποπολυσακχαρίτη, LPS, Ε. coli που προέρχονται, υποδεικνύοντας αμελητέα.

Κυτταρική καλλιέργεια των λευχαιμικών κυττάρων
Λευχαιμικά κύτταρα, ΤΗΡ-1 και U937 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Χαρακτηρίστηκε ως AML Μ5. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που αποτελείται από 90% RPMI 1640, 10% FBS, 100 U / ml πενικιλλίνη, 100 mg / mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Life Technologies, CA) και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2.

Γενιά των λευχαιμικών ΑΧ in vitro
Η γενιά των λευχαιμικών ΑΧ τροποποιήθηκε από ότι για την κανονική Μο-ΑΧ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11,21]. Λευχαιμικά κύτταρα ΤΗΡ-1 σε πυκνότητα 1 χ 105 ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν με / χωρίς GL-PS (100 μg / mL) σε παρουσία GM-CSF (40 ng / mL? Novartis Pharma Α6, Βασιλεία, Ελβετία) και IL-4 (40 ng / mL? Κ & ϋ Systems Inc, Minneapolis, ΜΝ) στους 37 ° C υπό 5% CO2. Την Ημέρα 3, το 90% του μέσου αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο και κυτοκίνες. ΤΗΡ-1 DCs συνέχεια συλλέχθηκαν κατά την Ημέρα 5 και πλύθηκε για περαιτέρω προσδιορισμούς. Για κανονική μονοκύτταρα που προέρχονται από αναπτυσσόμενες χώρες, τα μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν από φλεγμονώδη πλακούντα υγιών ενήλικων δοτών (Ερυθρός Σταυρός, το Χονγκ Κονγκ, Κίνα) με Ficoll-Paque Plus πυκνότητας (Amersham Biosciences, Ουψάλα, Σουηδία). Μονοκύτταρα στη συνέχεια απομονώθηκαν από PBMCs με θετική επιλογή χρησιμοποιώντας αντι-CD14 συζευγμένο με μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Τα απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 χ 106 κύτταρα / mL σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS, 50 IU / mL πενικιλλίνη και 50 IU / mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen) με GM-CSF και IL-4 στους 37 ° C υπό 5% CO2 για πέντε ημέρες. CD3 + Τ κύτταρα απομονώθηκαν με την ίδια μέθοδο, εκτός από τη χρήση αντι-CD3-συζευγμένο μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec.). Η καθαρότητα των απομονωμένων μονοκυττάρων ήταν σταθερά> 85% ενώ εκείνο των Τ κυττάρων ήταν σταθερά> 98% όπως προσδιορίζεται από την Coulter κυτταρόμετρο ροής EPICS (Coulter Corporation, Miami, FL). Με βάση την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα ανώριμα δενδριτικά την Ημέρα 5 ήταν 98,3% Οϋ11ο + CD1a + και 99,8% αρνητικές καταγωγή (CD3-, CD14-, CD16-, CD19-, CD20-, CD56-).

Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού
Οι επιδράσεις του GL-PS επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας ΧΤΤ Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Κιτ II (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 104 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν σε πλάκες επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων σε τελικό όγκο 100 μΐ μέσου καλλιέργειας επί μία νύκτα. Κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε GL-PS σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1 μg / ml έως 1 mg / mL) για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά τον σταθερό χρόνο της επώασης, 50 μΙ του μίγματος επισήμανσης ΧΤΤ προστίθεται σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2. Ο σχηματισμός της φορμαζάνης βαφών σε μίγμα επισήμανσης ΧΤΤ από μεταβολικά ενεργά κύτταρα ανιχνεύθηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων υπολογίσθηκε από την OD και εκφράζονται ως ποσοστό του αρνητικού ελέγχου. Να επιβεβαιώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από την αύξηση του αριθμού των κυττάρων, τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού του μπλε διεξήχθη με trypan μπλε χρωστική (Invitrogen). Τουλάχιστον 300 κύτταρα μετρήθηκαν υπό αιμοκυτόμετρο.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου
GL-PS-αγωγή λευχαιμικά κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Όταν για τον προσδιορισμό, τα αιωρήματα κυττάρων επωάστηκαν με RNase Α (100 μg / mL? Sigma) και ιωδιούχο προπίδιο (4 μg / mL? Sigma) σε PBS. Φάσεις του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν στη συνέχεια με Coulter Έπη κυτταρομετρίας ροής (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA). Το ποσοστό των G1, S και G2 / M προσδιορίστηκαν με Cylchred Έκδοση 1.0.2 (Cardiff University, Ουαλία, Ηνωμένο Βασίλειο). Για την έκφραση της πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), έχουμε τα κύτταρα χρωματίστηκαν με φλουορεσκείνη ισοθειοκυανικό (FITC) συζευγμένο αντίσωμα PCNA (BD PharMingen, San Diego, CA) μαζί με έλεγχο ισότυπο ΡΙΤΟ-IgGκ (BD PharMingen). Το κύτταρο αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής και τα δεδομένα αναλύθηκαν με ΜνίηΜϋΙ έκδοση λογισμικού ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής 2.8 (Πανεπιστήμιο Purdue, West Lafayette, IN).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής DCs
Την Ημέρα 5, DCs συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και σημάνθηκαν με φθοριοχρώμιο αντισώματα συζευγμένα. Μετά την επισήμανση, το κυτταρικό εναιώρημα πλύθηκε και επαναιωρήθηκε σε 300 μΙ 1% παραφορμαλδεΰδης για κυτταρομετρία ροής. Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), φυκοερυθρίνη (ΡΕ) και Phycoerthrin-cyanin 5.1 (PC5)-συζευγμένο ελέγχους ισοτύπου και CD14-ΡΕ, CD40-FITC, CD80-FITC, CD86-FITC, CD11c-ΡΕ και HLA-DR-PC5 αντισώματα ήταν αγοραστεί από BD PharMingen. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με Coulter κυτταρόμετρο ροής EPICS (Beckman Coulter) και αναλύθηκαν με λογισμικό ΜνίηΜϋΙ (Πανεπιστήμιο Purdue). Να μειώσει διακύμανση μεταξύ των πειραμάτων, οι μέσες εντάσεις φθορισμού για διαφορετικούς σημειωτές CD ομαλοποιήθηκαν με εκείνη του RPMI αντιμετωπίζονται αρνητικό μάρτυρα όπως σχετική ένταση φθορισμού.

ΡΙΤΟ-δεξτράνης δοκιμασία ενδοκυττάρωση
Λευχαιμικών κυττάρων που προέρχονται και που προέρχονται από μονοκύτταρα DCs συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε RPMI με 10% FBS. ΡΙΤΟ-δεξτράνη (μοριακό βάρος 40 kDa? Sigma) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 1 mg / mL. Κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C ή 4 ° C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τέσσερις φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής.

Δοκιμασία ELISA για κυτοκίνες
Τα υπερκείμενα από καλλιέργειες DCs συλλέχθηκαν μετά τη συγκομιδή των κυττάρων και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C μέχρις ότου προσδιορίστηκαν για κυτοκίνες. Τα επίπεδα της IL-12p70 και IL-10 μετρήθηκαν στη συνέχεια εις διπλούν με ανθρώπινο Duoset ® ELISA κιτ (R & D Systems Inc.) Η ανίχνευση κυμαίνεται για την IL-12 και IL-10 ήταν 31,25 έως 2000 pg / mL και 62,5 - 4.000 pg / ml, αντίστοιχα.

Αλλογενή μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση
Η λευχαιμικές προερχόμενο και μονοκύτταρα που προέρχονται από DCs ακτινοβολήθηκαν με μία γάμμα-ακτινοβολίας (Gammacell 1000 Elite, MDS Nordion Ιηα, Canada) σε 30 Gy και συν-καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 1:10 με 1 × 105 αλλογενή αποκριτή CD3 + Τ κύτταρα σε πλάκες μικροτιτλοδότησης επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων. Βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) προστέθηκαν σε φρεάτια 16 ώρες πριν από το τέλος των πέντε-ημέρες καλλιέργειας. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων κατά τη διάρκεια της τελευταία 16 ώρες της καλλιέργειας πέντε ημερών προσδιορίστηκε ποσοτικά από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ELISA, BrdU (χρωματομετρική) σετ (Roche Molecular Biochemicals).

στατιστική ανάλυση
Οι συγκρίσεις μεταξύ των μέσων τιμών με βάση τη δοκιμή t του Student μη παραμετρικές (2-tailed). Για περισσότερες από δύο ομάδες, σε σύγκριση με τα μέσα μονόδρομη ANOVA. Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική όταν ρ <0.05.

αντικρουόμενων συμφερόντων
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Συνεισφορές των συγγραφέων
WKC σχεδιαστεί, πραγματοποιήθηκαν πειράματα και έγραψε το χειρόγραφο? CCC πραγματοποιήθηκαν πειράματα, KWL σχεδίασε τα πειράματα και αναθεωρημένο χειρόγραφο, YLL παρέχονται τα υλικά και αναθεωρήθηκε χειρόγραφο? GCFC σχεδιαστεί, ανέλυσε τα δεδομένα και έγραψε το χειρόγραφο.

Ευχαριστίες
Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Επιτροπή Ερευνών και της Διάσκεψης επιχορηγήσεις (CRCG), το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Ho-Tung SK Φιλανθρωπικό Ταμείο και Pau KW Φιλανθρωπικό Ταμείο. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Lin ZB για την παροχή των καθαρισμένο πολυσακχαρίτες.